在针对新样品进行细菌内毒素检测的过程中,面对有色样品时,许多用户往往认为浊度检测试剂是唯一的选择,但事实真的如此吗?
一、认识你的敌人:深入了解细菌内毒素
细菌内毒素无疑是令人头疼的存在,作为革兰氏阴性细菌细胞壁内普遍存在的非感染性微粒,它能够触发免疫反应,引发发热、炎症乃至脓毒性休克等严重后果,极端情况下甚至可致命。鉴于此,药品和保健品若遭内毒素污染,将带来极大的安全隐患。因此,实施严格的内部细菌内毒素检测计划,对于确保这些产品以及医疗器械免受内毒素污染至关重要。BET(细菌内毒素检测)不仅是一项监管要求,更是维护公众健康不可或缺的关键环节。
图1. 革兰氏阴性细菌细胞内毒素结构示意图
二、出于对颜色的好奇:显色法检测背后的科学
您是否曾好奇动力学显色试验的奥秘?这项药典技术背后隐藏着令人惊叹的科学原理。
图 2. LAL级联机制描述和动力学显色试验的方法原理
显色试验之所以神奇,在于其结合了简便性、线性度和准确性。试验中,除了利用级联机制中的LAL酶(包括因子C、因子B和凝血酶原)外,还引入了显色底物这一关键元素。最初,显色底物呈无色状态,但当它与被细菌内毒素活化的凝血酶相遇时,一场化学反应悄然发生。
图3.ACC 显色试剂中使用的显色底物示例
凝血酶会裂解精氨酸-发色基质中的CO键,释放出一种叫做对硝基苯胺(pNA)的发色团——一种能吸收光(最大吸收值接近405nm的可见光)的微粒,从而引发溶液颜色变黄,这一变化肉眼可见。
为了精确测量这一颜色变化,科学家们采用吸收光分光光度计进行定量分析。根据以往经验,颜色的深浅程度与样品中细菌内毒素的含量成正比。因此,通过显色试验,我们能够快速、准确地评估样品中的细菌内毒素水平。
图4. 在405nm 波长处测量的吸光度与内毒素浓度定义的典型示意图
自20世纪90年代以来,显色检测技术凭借其独特的优势,彻底改变了细菌内毒素检测领域的游戏规则,成为生物学与比色法完美结合的典范。
三、重组显色测试如何进一步提高产出?
重组显色检测法通过引入几项突破性功能,将其优势提升到了新的高度。
图5. 一个典型的微孔板显示了动力学显色试验的颜色变化
首先,重组级联试剂(rCR)PyroSmart NextGen®采用了重组因子C、重组因子B和重组凝固酶原,这些因子是从美洲鲎(Limulus polyphemus)中基因克隆并表达的级联酶制剂,这一变革使得检测过程中无需再使用动物源成分,从而实现了更加环保的检测方式。
图6. 重组级联试剂的作用机制
此外,PyroSmart NextGen®试剂中不含动物源LAL试剂中的原生成分因子G,这一改进避免了因(1→3)-β-D-葡聚糖(一种常见污染物)引发的共敏性问题,进而显著降低了检测结果超范围的风险。
图7. 含有和不含(1→3)-β-D-葡聚糖加标的两个RSE标准系列的起始时间(秒)的线性回归
图8.使用六种不同批次的PyroSmart NextGen®的RSE标准曲线系列,显示出很强的批次一致性
尤为重要的是,该试剂确保了批次间结果的高度可重复性,这一特性为质量控制实验室实现标准化和现代化,特别是推动移液自动化进程,奠定了坚实的基础。
在ACC(Associates Of Cape Cod),PyroSmart NextGen®于相同的cGMP条件下生产,保证了其质量和性能的一致性和可靠性。与此同时,rCR与我们已获得FDA许可的LAL试剂一样,均在通过ISO 14385认证的工厂生产,这不仅确保了检测结果的可靠与可重复,也使rCR成为细菌内毒素检测领域中一个值得信赖且可持续的解决方案。
四、揭开秘密:有色样品检测背后的数据
有一种常见的误解,认为显色法在处理有色样品时会遇到困难。然而,通过实际数据和经验证明,当方法适用性良好时,显色法,包括重组显色法,能够高效且准确地检测有色样品。根据USP<85>和<1085>的规定,对所有样品进行方法适用性测试是常规测试前的必要步骤,这有助于确定适当的检测方法,并评估检测设置(如试剂类型、方法类型和仪器)与样品的兼容性。
趣闻1:大多数药物样本类型都会干扰BET。
趣闻2:绝大多数样品干扰都可以通过简单的BET检查用水稀释[如LAL试剂水(LRW)]来克服。
有色样品也不例外。除了固有的颜色外,它们通常还可能含有干扰测试的成分。根据我们的经验,用LRW(如无热原水)稀释极有可能在一个简单的步骤中解决光学和化学干扰这问题。
除了稀释外,还有另一个非常有价值的工具:仪器和软件。先进分光光度法的出现大大缓解了人们对测试有色样品的担忧。基线设置和归零在此过程中起着关键作用。例如,在Pyros Kinetix® Flex试管阅读器中,每个孔都要单独计时和评估,它涉及记录样品的初始吸光度。这基本上是在任何反应发生之前通过样品的固有颜色来测量吸光度。然后将此基线读数用作所有一系列稀释中(不超过最大有效稀释度)后续10秒测量的参考点,从而可以准确捕获真实的颜色强度增加,而与样品本身的颜色无关。
Pyros Kinetix® Flex由Pyros® eXpress软件提供支持,该软件内置了每孔检索原始数据的规范。在初始归零期间,在405nm波长处吸收强烈颜色的样品会产生较低的透射率值,因此会在软件中标记为超出范围,提醒操作员采取进一步措施。
五、案例研究:显色法在有色样品测试中的实际应用
那么,这一切是如何实现的呢?让我们来看看MIC注射剂的可比性测试——一种维生素混合注射剂,由主要化合物(蛋氨酸、肌醇、胆碱)和其他成分(如维生素B12)组成。根据各成分的浓度,最终制备可能如下所示:
图9. MIC注射液的系列稀释
LRW中的稀释系列(MVD=14000)
加入BET水后,有色背景会被进一步稀释
使用动态浊度法(KTA)测试MIC注射液所有测试系列稀释的阳性对照和阳性样品对照的数据收集图(加标浓度为0.5 EU/mL):
图10. 在Pyros Kinetix® Flex管式读数器中进行动态浊度测试时,对添加了0.5EU/mL的MIC注射稀释液的范围进行的数据采集图
解释:原液-未经测试。浓缩的MIC注射液呈深黄色,能非特异性地吸收整个可见光光谱。
图11. 使用动态显色法在Pyros Kinetix® Flex管式阅读器上进行检测时,对添加0.5EU/mL的注射稀释液范围所绘制的数据采集图
(1)1:10的PPC - 固有颜色对于浊度测试来说仍然太深,仍然会非特异性地吸收通过的光,Pyros® eXpress会在测试开始60秒后通知用户透射率规格未达标。
(2)1:100的PPC - 在0到800秒之间会有残余的光学干扰,然后会被与细菌内毒素反应有关的浊度变化所克服。
(3)1:1000的PPC - 无光学干扰。
(4)1:10000的PPC - 无光学干扰。
总之,浊度测试与显色测试观察到的光学干扰程度相同。在 1:100时观察到残余干扰。用两种LAL方法检测时,1:1000稀释液都没有光学和化学干扰,因此可以选择1:1000稀释液进行进一步检测和验证。
使用PyroSmart NextGen®进行了其他测试,将MIC注射液按1:500稀释,足以克服光学干扰。
六、专家意见:质量控制技术人员参与其中
在制药质量控制领域,领先的科学家和管理人员已成功验证了有色样品的动态显色法测试。他们的实践表明,根据具体情况,测试策略可灵活选择:一些团队直接采用显色技术,看重其宽动态范围的优势;有的则从浊度技术入手,逐步过渡到显色技术;特别是对新产品的内部测试,有些企业直接应用重组显色法来检测有色样品。
除了卓越的分析性能,光度测定技术还积极响应3R原则(减少、替代、回收),显著降低了试剂中动物源性原料的使用,而重组试剂更是完全摒弃了这类原料。
七、关于稀释:获得准确结果的关键
在检测过程中,正确的稀释技术是确保有色及无色样品获得准确结果的关键,有助于消除对显色检测能力的误解。通过深入理解反应成分,运用合适的仪器和软件平台,并有效利用其内置功能来标识不合格样品,用户能在检测初期迅速识别问题。经过适当的方法开发,显色技术在有色样品检测上的表现与浊度技术相当,甚至在低稀释度下,重组显色法也能验证结果的有效性,根据专家意见、经验数据和对动物福利的伦理要求,证明重组显色法不受样品颜色影响的稳健性、可持续性和可靠性。
这些先进方法的采用,标志着药品质量控制向更加标准化和现代化的程序迈进,不仅提升了检测效率,还确保了医疗产品的安全性和有效性。