在进行细菌内毒素检测的过程中,技术人员常面临各种挑战与疑问,为解决这些问题,科德角国际汇总了客户咨询的常见问题,并以详尽的问答形式提供了指导性的解答,为相关从业者提供参考。
对于不同类型的细菌内毒素标准品,其溶解方法有所不同。
▶▶美国药典USP细菌内毒素标准品(USP-RSE):加入5mL细菌内毒素检测用水(2000EU/mL),再剧烈涡旋30分钟。
▶▶科德角国际欧洲药典细菌内毒素参考标准品(BRP):将5mL细菌内毒素检测用水添加到小瓶中。使用涡旋混合器间歇混合30分钟以复溶,以获得初始浓度2000EU/mL的储备溶液。
▲欧洲药典细菌内毒素参考标准品
▶▶科德角国际ACC细菌内毒素工作标准品(CSE-E0005):加入细菌内毒素检测用水使细菌内毒素初始浓度达到1000EU/mL(具体浓度参考试剂CoA),剧烈涡旋1分钟,静置5分钟,重复5次以充分溶解。
▲细菌内毒素工作标准品(CSE)
在中国药典的规定下,进行细菌内毒素检测时应使用药典规定的细菌内毒素标准品,包括USP-RSE、EP-BRP、CSE以及中国食品药品检定研究院的细菌内毒素国家标准品。
凝胶法主要用于半定量分析,而显色法和浊度法则用于定量分析。
显色法和浊度法虽然大体相似,但在检测原理、检测波长、检测试剂、检测范围以及检测成本上均存在差异,因此在选择这两种方法之前,需要根据实际需求进行审慎而合理的考量。
当凝胶法、显色法和浊度法的检测结果出现疑问或争议时,应以凝胶法的结果作为最终的判定依据。
在进行细菌内毒素检测时,虽然不必使用专用的检测耗材,但必须使用不含细菌内毒素或β-葡聚糖的器具。
玻璃器具可通过超过250℃的干热灭菌30分钟以上来灭活细菌内毒素,同时需避免使用可能释放微量金属离子(如Fe、Al、Ga、Cr等)影响检测结果的金属器具。
此外,对于一次性塑料器具,除需获得生产商的保证外,还应确认其不受细菌内毒素污染、不吸附细菌内毒素,且洗脱物不含影响检测结果的物质。
对于药典中未规定细菌内毒素限值的样品,其限值公式如下:
内毒素限值(EU/mL)= K值(EU/kg)/人最大给药量(mL/kg)
其中,K值根据给药途径的不同而有所差异。
频繁或连续注射时,人最大给药量为1小时内注射的最大剂量。
▶▶参考
日本、美国、欧洲药典规定的K值(致热细菌内毒素量)
计算公式如下:
▶▶ λ:凝胶法中表示鲎试剂的标示灵敏度,光度法中表示细菌内毒素标准曲线范围的最小浓度。
此外,科德角国际的Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统配套软件“PEXS”带有MVD自动计算功能,方便用户进行快速准确的计算。
▲Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统
对于不溶于水的样品,如果能溶于1%乙醇或1%DMSO,在进行检测时不会对鲎试剂造成影响。
保存样品时需注意以下几点:
● 确保样品中无活菌繁殖;
● 细菌内毒素值不会随保存期而发生变化;
● 确保保存容器无细菌内毒素污染,无细菌内毒素吸附,不含影响检测结果的洗脱物。
如果样品溶液的pH值不在6.0~8.0范围内,则需要进行调节以确保检测准确性。细菌内毒素检测的最佳pH值约为7.3,但由于鲎试剂中含有缓冲成分,此该检测在pH6.0至8.0的范围内均可进行。
对于可稀释的样品,可通过稀释来调整pH值;对于不可稀释的样品,则可在样品溶液中加入稀NaOH或HCl溶液来调节pH值。
此外,也可利用缓冲液来稀释样品溶液。为确保调节效果,建议使用按需配制的NaOH或HCl溶液来调整pH值。
检测用试管不可重复使用。稀释或样品保存用试管可在进行250℃超过30分钟的干热灭菌后重复使用。